KROMATOGRAFI

KROMATOGRAFI
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang

Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusunan cuplikan antara dua fasa.
Satu fasa tetap tinggal pada system dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Prosedur kromatografi masih dapat digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah, kompleksitas campuran yang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang dipisah.
Kromatografi ada bermacam-macam diantaranya kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, penukar ion, penyaringan gel dan elektroforesis.
Asam-asam amino yang terdapat dalam protein adalah asam ? – amino karboksilat. Asam amino ada yang larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organic. Asam amino yang tidak dapat dibuat oleh tubuh disebut asam amino essensial dan ada juga asam amino yang dapat dibuat oleh tubuh disebut asam amino nonessensial.

1.2. Tujuan

– Menghitung Rf asam amino yang sudah diketahui.
– Dalam penelitian suatu sampel asam amino yang belum diketahui namanya dapat dianalisa dengan menghitung nilai Rf.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Suatu analisis kimia menjadi meragukan jika pengukuran sifat tidak berhubungan dengan sifat spesifik senyawa terukur. Analisis meliputi pengambilan cuplikan, pemisahan senyawa pengganggu, isolasi senyawa yang dimaksudkan, pemekatan terlebih dahulu sebelum identifikasi dan pengukuran. Banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak digunakan. Kromatografi pertama kali diberikan oleh Michael Tswett, seorang ahli botani Rusia, pada tahun 1906.
Kromatografi berasal dari bahasa Yunani ‘Kromatos’ yang berarti warna dan ‘Graphos’ yang berarti menulis. Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari penyusun cuplikan antara dua fasa. Satu fasa tinggal pada system dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya, dinamakan fasa gerak, memperkolasi melalui celah-celah fasa diam. Gerakan fasa menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan.
Macam-macam kromatografi
a. Kromatografi Lapis Tipis
Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.
b. Kromatografi Penukar Ion
Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion. Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang Dunia II telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarang dan asam amino.
c. Kromatografi Penyaringan Gel
Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya. Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.
d. Elektroforesis
Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak. Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda. Sedangkan kecepatan gerak tergantung pada besarnya muatan.
e. Kromatografi Kertas
Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Teknik ini sangat sederhana.
Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi sutu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air atau campuran pelarut.
Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering kertas dimasukkan dalam bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).
Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau noda yang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia. Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksi yang memberikan sebuah warna terhadap beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi, maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan harga Rf.
Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.
Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan jarak tepi muka pelarut dari titik awal.
Rf = Jarak titik tengah noda dari titik awal
Jarak tepi muka pelarut dari titik awal

Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:
1. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
2. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
3. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.
4. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga mempengaruhi kesetimbangan partisi.
5. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.
Protein merupakan poliamida dan hidrolisis protein menghasilkan asam-asam amino. Hanya dua puluh asam amino yang lazim dijumpai oleh protein tumbuhan dan hewan. Namun ke-20 asam amino ini dapat digabungkan menurut berbagai cara, membentuk otot, urat, kulit, kuku, hemoglobin, enzim, antibody dan banyak hormon.
Asam-asam amino yang terdapat dalam protein adalah asam ?-amino karboksilat. Variasi dalam struktur monomer-monomer ini terjadi dalam rantai samping.
COOH
Gugus ?-amino H2N- C- H
R Variasi struktur terjadi dalam rantai samping

Asam amino tersederhana adalah asam aminoasetat (H2NCH2COOH) yang disebut glisin, yang tidak memiliki rantai samping, karena itu tidak mengandung satu karbon kiral. Semua asam amino lain memiliki rantai samping dan kertas itu karbon ?-nya bersifat kiral.
Asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti eter, aseton dan kloroform. Sifat asam amino berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan sifat amina. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri dari beberapa atom karbon umumnya kurang larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik. Amina pada umumnya tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik.
Berdasarkan struktur rantai sampingnya, asam amino dibagi dalam 7 kelompok, yaitu:
1. Merupakan rantai karbon yang alifatik
2. Mengandung gugus hidroksil
3. Mengandung atom belerang
4. Mengandung gugus asam dan amidanya
5. Mengandung gugus basa
6. Mengandung gugus atau cincin aromatik
7. Membentuk ikatan dengan atom N pada gugus amino
Beberapa fungsi asam amino disamping untuk sintesis protein dan produksi energi:
a. Alanin, Prekursor glukogenik, pembawa N dari jaringan permukaan untuk ekskresi N.
b. Aspartat, biosintesis urea, prekursor glukogenik, prekursor pirimidin.

c. Sistein, prekursor taurin (untuk konjugasi asam empedu dan fungsi lain), pereduksi.
d. Glutamat, pereduksi antara dalam reaksi interkonversi asam amino, neutransmiter ?-aminobutirat, sumber NH3.
e. Glutamin, donor-grup amino untuk banyak reaksi non asam amino, pembawa N (lebih mudah melewati membran daripada glutamat, sumber NH3.
f. Glisin, prekursor biosintesis purin, neotransmitter.
g. Histidin, prekursor histamin.
h. Lisin, untuk crosslinking protein (seperti pada kolagen dan elastin), biosintesis karnitin.
i. Metionin, donor grup metil untuk banyak proses sintetik, prekursor sistein.
j. Fenil alanin, prekursor tirosin dan melalui tirosin, juga prekursor katekolamin, DOPA, melanin dan tiroksin.
k. Serin, komponen fosfolipid, prekursor sfingolipid, prekursor etanolamin dan kolin.
l. Triptofan, prekursor serotonin, prekursor nikotinamid (vitamin B).

Asam amino yang tidak dapat dibuat dalam tubuh disebut asam amino essensial dan harus diperoleh dari makanan sumber protein. Asam amino yang dapat dibuat dalam tubuh disebut asam amino non essensial.
Semua vertebrae, termasuk manusia dapat membentuk 12 macam asam amino yang secara nutrisi non essensial dari senyawa antara amfibolik atau dari asam amino lain yang ada dalam makanan. Vertebrae tidak dapat melakukan biosintesis 10 asam amino yang secara nutrisi essensial. Vertebrae melakukan biosintesis asam amino dari senyawa antara amfibolik lewat lintasan metabolic yang meliputi 5 atau kurang reaksi yang dikatalisis oleh enzim.
Reaksi untuk asam amino
Pada asam amino, gugus (-COOH) dan (-NH2)nya masing-masing dapat bereaksi, missal dengan pembentukkan garam, esterifikasi dan asilasi. Reaksi umum untuk menunjukkanadanya asam amino adalah reaksi ninhidrin. Ninhidrin adalah suatu oksidator yang menyebabkan dekarboksilasioksidatif dari asam alfa amino, menghasilkan CO2, NH3 dan aldehid yang rantai Cnya lebih pendek satu atom C daripada asam amino asalnya.
Ninhidrin yang tereduksi kemudian bereaksi dengan NH3 yang dibebaskan membentuk senyawa kompleks berwarna biru dengan absorpsi warna maksimum pada panjang gelombang 570 nm. Cara ini dapat dipakai untuk mengukur kadar asam amino.
Senyawa asam amino, kecuali asam amino dapat memberi reaksi ninhidrin positif, tetapi tanpa pembentukkan CO2 asam-asam amino aromatis, seperti triptofan, tirosin, histidin dan fenil alanin menyerap sinar ultraviolet. Serapan sinar ultraviolet oleh protein kebanyakan ditentukan oleh kandungan triptofannya.
Bermacam-macam asam amino dapat diidentifikasi dengan reaksi warna khusus, karena reaksi warna khusus ini positif untuk gugus tertentu pada rantai R-nya bukan untuk gugus (-COOH) ataupun (-NH2)nya.
Reaksi warna tersebut ialah:
No Asam amino Reaksi petunjuk Reaksi positif bila terjadi warna
1 Arginin Sakaguchi Merah
2 Sistein Nitropussid dan Sullivan Merah
3 Histidin Pauly Merah
4 Triftopan Hopkins cole Ungu
Ehrlich Biru
5 Tirosin Pauly Merah
Millon-Nasse Merah
Folin-Ciocalteu Merah
6 Fenil alanin Santo Protein Kuning

BAB III
METODE PERCOBAAN

3.1. Alat
– Beker glass
– Gelas ukur
– Kertas kromatografi
– Lidi
– Lemari kromatografi
– Pipet tetes
– Penggaris
– Semprotan

3.2. Bahan
– Asam asetat
– Asam butanol
– Aquades
– Triptofan
– Alanin
– Glisin
– Serin
– Campuran (Triptofan, Alanin, Glisin, serin)
– Ninhidrin

3.3. Cara Kerja
a. Penjenuhan kertas kromatografi
– Disiapkan beker glass lalu diisi dengan asam butanol sebanyak 25 ml, asam asetat 5 ml dan air 25 ml. Pelarut asam amino ini semuanya 55 ml.
– Disiapkan kertas kromatografi dan diberi garis dasar dengan jarak 1,5 cm dari tepi bagian bawah kertas lalu dibuat 5 titik pada garis tersebut dengan pensil.
– Kertas kromatografi dijepit dengan lidi dan dimasukkan ke dalam beker glass yang berisi pelarut tetapi bagian bawah kertas tidak boleh mengenai pelarut
– Kertas didiamkan selama ± 2 jam, bagian atas beker glass ditutup agar pelarut tidak terlalu banyak menguap keluar dan kertas menjadi jenuh.
b. Penentuan kelarutan Asam amino
– Kertas kromatografi yang sudah dijenuhkan diangkat
– Disiapkan sampel yang akan dipisahkan
– Ditotolkan sampel yang ingin dipisahkan pada kertas kromatografi. Tiap sampel diteteskan sebanyak 4 tetes pada titik yang sama
– Setelah sampel ditotolkan, kertas kromatografi dimasukkan ke dalam beker glass berisi pelarut dengan bagian bawah menyentuh pelarut. Didiamkan sampai pelarut tidak lagi merembes ke atas
– Kertas kromatografi dianginkan, noda sampel terakhir ditandai dengan pensil, kertas dipanaskan selama ± 5-10 menit
– Disemprot kertas kromatografi dengan ninhidrin dan dipanaskan lagi
– Diukur noda dari titik awal
c. Menghitung nilai Rf
– Diukur jarak pelarut dari garis dasar hingga titik akhir pelarut tidak merembes lagi
– Diukur jarak tiap sampel dari garis dasar
– Dihitung nilai Rf
Rf = Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar

Sampel Jarak Tempuh
Sampel (Cm) Jarak Tempuh
Pelarut (Cm)

Triptofan

Alanin

Glisin

Serin

Campuran 5

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Pengamatan

Sampel Jarak Tempuh
Sampel (Cm) Jarak Tempuh
Pelarut (Cm)

Triptofan

Alanin

Glisin

Serin

4.2. Pembahasan
Dari data pengamatan dapat dilihat triptofan memiliki jarak paling jauh dibandingkan dengan asam-asam amino lainnya, sedangkan serin memiliki jarak yang paling dekat. Ini dikarenakan asam butanol bersifat semi polar tetapi lebih cenderung ke non polar, asam asetat bersifat polar dan air bersifat sangat polar, sehingga setelah ke- 3 pelarut ini dicampur dengan perbandingan 5 : 2 : 5 maka larutannya akan menjadi bersifat semi polar.
Pada glisin dan serin jarak yang ditempuh tidak terlalu jauh dari garis dasar dikarenakan glisin dan serin bersifat polar, karena kertas merupakan fase diam yang didalamnya mengandung selulosa yang banyak mengandung gugus OH maka yang sifatnya sama akan tertahan.
Untuk serin yang memiliki jarak paling dekat, ini dikarenakan rantai samping serin adalah gugus OH yang bersifat sangat polar. Karena memiliki OH maka sifatnya sama dengan fasa diam atau fasa stasioner, inilah yang menyebabkan air tertahan di kertas.
Untuk alanin dan triftopan memiliki sifat non polar, berbeda dengan kertas yang bersifat polar, sehingga jarak tempuhnya jauh. Rantai samping triptofan mempunyai sifat non polar, maka sisi non polar bergerak terus mengikuti gerak pelarut atau terikut oleh fase gerak, karena itu triptofan memiliki jarak yang paling jauh.
Pada sampel campuran jarak tempuhnya hampir sama dengan triftopan, karena di dalam sampel campuran ini ada triptofannya yang mempunyai kecendrungan bergerak mengikuti pelarut.
Dari kelima sampel yang membedakan jauh atau dekatnya jarak yang ditempuh tergantung dari kecendrungan gugus non polar mengikuti pelarut.
Rumus struktur asam-asam amino yang digunakan sebagai sampel:
CH3 – CH – COOH
NH2
2- amino asam propanoat
* Alanin *

CH2 – CH – COOH H – CH – COOH
OH NH2 NH2
2- amino-3- hidroksi asam propanoat Amino asam asetat
* Serin * * Glisin *
Warna biru yang terdapat pada kertas kromatografi, setelah disemprot dengan ninhidrin dan dikeringkan merupakan reaksi antara ninhidrin dengan asam amino yang menghasilkan hidrindantin dan kemudian ninhidrin bereaksi dengan hidrindantin dan ammonia.
Reaksi:

Sebelum digunakan kertas kromatografi dijenuhkan terlebih dahulu, hal ini dilakukan agar pelarut atau uap pelarut yang digunakan akan tersangkut atau tertahan pada kertas kromatografi.
Untuk nilai Rf didapatkan dari perbandingan antara jarak yang di tempuh oleh sampel dari garis dasar dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari garis dasar.
Rf = Jarak yang ditempuh sampel dari garis dasar
Jarak yang ditempuh pelarut dari garis dasar

Nilai Rf dari asam amino yang sudah diketahui, dapat membantu kita menganalisa suatu asam amino yang belum diketahui namanya dengan cara membandingkan nilai Rf nya.
Triptofan termasuk asam amino esensial, sehingga tidak dapat dibuat oleh tubuh dan harus mendapat pasokan dari luar yaitu melalui makanan. Triptofan merupakan asam amino heterosiklik yang mula-mula diperoleh dari hasil pencernaan kasein oleh cairan pancreas. Sedangkan alanin, glisin dan serin merupakan asam amino non esensial yang dapat dibuat oleh tubuh, sehingga tidak memerlukan pasokan dari luar tubuh karena yang dibuat oleh tubuh sudah mencukupi untuk kebutuhan dalam tubuh.
Glisin adalah asam amino yang paling sederhana dan terdapat pada skleroprotein. Alanin adalah semua asam amino, kecuali glisin dapat dianggap sebagai derivat alanin. Serin merupakan asam amino yang mempunyai gugus alcohol diperoleh dari hasil hidrolisis gelatin

BAB V
PENUTUP

5.1. Kesimpulan
– Prinsip dasar kromatografi terdistribusi jadi fase diam dan fase gerak.
– Pelarut yang terdiri dari (asam asetat, asam butanol dan aquades) merupakan fasa gerak, sedangkan asam-asam aminonya merupakan fasa stasioner (diam).
– Penjenuhan kertas kromatografi bertujuan agar pelarut yang digunakan tertahan di kertas.
– Jauh atau dekatnya jarak tempuh suatu sampel tergantung dari sifat polar dan non polar rantai sampingnya yang mengikuti pelarut.
– Triptofan mempunyai jarak terjauh yaitu 5 cm, alanin 2,4 cm, glisin 1,7 cm, dan yang terdekat adalah serin dengan jarak 1,6 cm, campuran mempunyai jarak yang hampir sama dengan triptofan yaitu 4,2 cm karena campuran mengandung triptofan.
– Pereaksi ninhidrin digunakan sebagai pereaksi yang menghasilkan warna biru untuk memudahkan identifikasi suatu senyawa berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut menggunakan harga Rf.
– Nilai Rf didapat dari perbandingan jarak antara yang ditempuh oleh sampel dari garis dasar dengan jarak yang ditempuh oleh pelerut dari garis dasar.
– Untuk mengetahui asam amino yang belum diketahui namanya dapat dianalisa dengan membandingkan nilai Rf dari asam amino yang sudah diketahui namanya.

Rumus Struktur Serin :

HOCH2CHCO2H

NH2

Rumus Struktur Triplofan :

Reaksi Ninhidrin + Asam Amino :

Reaksi Ninhidrin + NH3 + Asam Amino :

R – CH – COOH + Ninhidrin teroksidasi ?
NH2 R – CH + NH3 + CO2 + Ninhidrin tereduksi
O

+ NH3 +

Ninhidrin teroksidasi Ninhidrin tereduksi

N = + 3 H2O

Produk berwarna biru

Tambahan Pembahasan
Karena gula atau keton bebas mereduksi kuproksida menjadi kaprioksida sehingga benedict menghasilkan bermacam-macam warna.

Reaksi glukosa + Benediot

+ +

<!–
google_ad_client = “pub-7659153469404382”;
google_ad_type = “text”;
google_ad_channel = “”;
google_ad_width = 468;
google_ad_height = 60;
google_language = “en”;
google_ad_format = “468x60_as”;
google_color_border = “336699”;
google_color_bg = “FFFFFF”;
google_color_link = “336699”;
google_color_url = “FF8C00”;
google_color_text = “000000”;
//–>

• click link
• 1345 clicks